非选择题-解答题 较难0.4 引用4 组卷380
癌细胞表面蛋白“PDL﹣1”与T细胞表面蛋白“PD﹣1”特异性结合后,可抑制T细胞活性并启动其凋亡,导致肿瘤细胞发生免疫“逃逸”。研究者对“PD﹣1”基因进行克隆、表达及生物学活性鉴定,为制备抗体打基础。研究中所用引物α和β碱基序列见图1、几种常用限制酶名称及识别序列与酶切位点见图2:
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(1)首先提取细胞中的mRNA反转录生成_____ 作为模板:设计含有不同的限制酶切点的α和β序列为引物,通过_____ 技术扩增目的基因。
(2)选用图1中的两种名称分别为_____ 的限制酶将“pIRES2﹣EGFP质粒”载体进行双切,再用DNA连接酶将其与目的基因拼接,构建表达载体。该表达载体的组成,除了目的基因、标记基因抗卡那霉素基因外,还必须具有_____ 等
(3)而后一定温度下,与经过Ca2+处理的感受态大肠杆菌混合培养在含有_____ 培养基中,可筛选出已经完成转化的大肠杆菌,继续培养该种大肠杆菌以扩增重组DNA。
(4)将扩增后的“pIRES2﹣EGFP载体/PD﹣1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后,为确定PD﹣1基因是否表达,检测细胞膜表面是否具有_____ 。为判断其是否具有生物学活性和功能,则可裂解293T细胞,提取该物质看能否与_____ 发生结合,从而阻断“PD﹣1与PDL﹣1信号通路”。研究中还会有一步骤,只将“pIRES2﹣EGFP载体”转入293T细胞,其目的是_____ 。
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(1)首先提取细胞中的mRNA反转录生成
(2)选用图1中的两种名称分别为
(3)而后一定温度下,与经过Ca2+处理的感受态大肠杆菌混合培养在含有
(4)将扩增后的“pIRES2﹣EGFP载体/PD﹣1重组DNA”转入可高度表达外源基因的原代293T细胞。一段时间后,为确定PD﹣1基因是否表达,检测细胞膜表面是否具有
2019·湖南·二模
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CD87是一种癌细胞膜上的受体蛋白,与癌细胞的转移和增殖有关。研发针对CD87的抗体类药物能提高癌症的治愈率。
(1)单克隆抗体制备过程如图1所示:
细胞①表示小鼠的____ 细胞,使用HAT培养基筛选获取杂交瘤细胞的原理是____ ;获取杂交瘤细胞后,需在全营养培养基中培养一段时间,目的是____ 。采用____ 法获取单细胞,并培养形成克隆。通过筛选的杂交瘤细胞可通过注入小鼠腹腔或在培养液中进行扩大培养并不断产生单克隆抗体。
(2)双特异性抗体是指同时具有两种抗原结合位点的人造抗体,研究人员利用基因工程和发酵工程技术制备具有CD3和CD87结合位点的双特异性抗体(见图2)。
备注:CD3是T细胞表面特异性抗原,在所有T细胞膜上均有表达。该抗原被激活后,能极大促进T细胞的免疫效力
①设计目的基因序列:通过查阅基因数据库,获得CD3和CD87蛋白对应的碱基序列和氨基酸序列,为使两种抗体蛋白能结合形成有功能的抗体,利用计算机辅助设计技术,设计改造蛋白质的____ ,推测其可能的氨基酸序列和碱基序列。
②获取目的基因:利用____ 获取目的基因后,通过PCR扩增,采用的引物如图3所示。
③构建重组质粒:选用含LacO位点的质粒作为载体。LacO位点常与阻遏蛋白结合,阻止RNA聚合酶的移动,环境中的乳糖能解除阻遏蛋白的作用。将目的基因与质粒连接,形成图4所示的重组质粒。LacO位点的作用是____ 。
④重组质粒的导入和检测:将重组质粒与经低温、低浓度CaCl2处理的大肠杆菌共培养一段时间,将菌种接种在含四环素的培养基中培养一段时间,获得的大肠杆菌需鉴定是否含有重组质粒,原因是____ 。提取大肠杆菌总DNA后,根据表中4种限制酶的识别序列,采用____ 酶进行酶切,电泳后若存在1150bp左右长度的条带,则说明导入了重组质粒。
⑤双特异性抗体的生产:将筛选出的大肠杆菌扩大培养后,接种在发酵罐中进行大规模发酵。生产过程中需要持续检测的指标是____ (写出3个)。
(3)相对于单克隆抗体,图示双特异性抗体在治疗癌症时的效果更好,推测原因是____ 。
(1)单克隆抗体制备过程如图1所示:
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细胞①表示小鼠的
(2)双特异性抗体是指同时具有两种抗原结合位点的人造抗体,研究人员利用基因工程和发酵工程技术制备具有CD3和CD87结合位点的双特异性抗体(见图2)。
![](https://img.xkw.com/dksih/QBM/editorImg/2024/1/6/02ddda0b-a6f1-4c29-bf05-67bc404db497.png?resizew=337)
备注:CD3是T细胞表面特异性抗原,在所有T细胞膜上均有表达。该抗原被激活后,能极大促进T细胞的免疫效力
①设计目的基因序列:通过查阅基因数据库,获得CD3和CD87蛋白对应的碱基序列和氨基酸序列,为使两种抗体蛋白能结合形成有功能的抗体,利用计算机辅助设计技术,设计改造蛋白质的
②获取目的基因:利用
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③构建重组质粒:选用含LacO位点的质粒作为载体。LacO位点常与阻遏蛋白结合,阻止RNA聚合酶的移动,环境中的乳糖能解除阻遏蛋白的作用。将目的基因与质粒连接,形成图4所示的重组质粒。LacO位点的作用是
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④重组质粒的导入和检测:将重组质粒与经低温、低浓度CaCl2处理的大肠杆菌共培养一段时间,将菌种接种在含四环素的培养基中培养一段时间,获得的大肠杆菌需鉴定是否含有重组质粒,原因是
酶 | 识别序列 |
EcorI | 5’-G^AATTC-3’ |
BgIII | 5’-A^GATCT-3’ |
BamHI | 5’-G^GATCC-3’ |
XhoI | 5’-C^TCGAG-3’ |
备注:“^”表示酶切位点 |
(3)相对于单克隆抗体,图示双特异性抗体在治疗癌症时的效果更好,推测原因是
PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因, 研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题:
(1)为获取phb2基因,提取该动物肝脏组织的________ ,再经________ 过程得到cDNA,将其作为PCR反应的模板, 并设计一对特异性引物来扩增目的基因。与生物体内的DNA聚合酶相比,PCR技术中所用的DNA聚合酶特点是________ 。
(2)图为所用载体图谱示意图,质粒DNA含有启动子,启动子是________ 识别并结合的位点。质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能________ 。
注:箭头表示切割位点
(3)构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶,其中,DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________ 。图1中限制酶的识别序列及切割位点见表,为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端分别引入________ 和________ 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用________ (填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。
(4)转化前需用________ 处理大肠杆菌细胞,使其处于________ ,以提高转化效率。将转化后的大肠杆菌接种在含________ 的培养基上进行培养。
(1)为获取phb2基因,提取该动物肝脏组织的
(2)图为所用载体图谱示意图,质粒DNA含有启动子,启动子是
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名称 | 识别序列及切割位点 | 名称 | 识别序列及切割位点 |
HindⅢ | A↓AGCTT | EcoRI | G↓AATTC |
PvitⅡ | CAG↓CTG | PstI | CTGC↓AG |
KpnI | G↓GTACC | BamHI | G↓GATCC |
(3)构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶,其中,DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
(4)转化前需用
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