某小组为构建含有双标记基因的通用型动物转基因载体（质粒b），将1种标记基因（Neo基因）插入到质粒a中。但Neo基因两端无相应的限制酶识别序列，因此需要先设计一-组卷网

非选择题-解答题较易0.85 引用2 组卷104

某小组为构建含有双标记基因的通用型动物转基因载体（质粒b），将1种标记基因（Neo基因）插入到质粒a中。但Neo基因两端无相应的限制酶识别序列，因此需要先设计一对引物，让Neo基因的两端分别增加相应的序列，然后通过PCR扩增得到DNA序列1，再经过酶切和连接后得到质粒b。构建动物转基因载体的过程如下图所示。（其中扩增DNA序列1的引物为：P1 5＇-TATGTCGAC……3＇；P2 5＇-TATATCGAT……3＇。限制酶及其识别序列为Hind Ⅲ： A^↓AGCTT、Sal Ⅰ：G^↓TCGAC、ClaⅠ： AT^↓CGAT NheⅠ ： G^↓CTGGC）回答下列问题：

(1)根据引物分析，应使用______________（填限制酶名称）对DNA序列1和质粒a进行切割，经_______酶连接后得到质粒 b。
(2)含有Neo基因的细胞对G418 （一种抗生素）具有抗性，可用含G418的培养基筛选转基因细胞。为检测质粒b是否成功插入了Neo基因，首先将质粒b转染羊成纤维细胞，然后对细胞进行抗性检测。
①培养成纤维细胞的过程中，需要用_______________处理贴壁细胞，使之分散成单个细胞，离心收集后再进行传代培养。
②将转染质粒b的成纤维细胞分为两组（T₁、T₂），CTR组为未转染质粒b的成纤维细胞，进行细胞培养，结果如下表，T₂组的细胞生长情况为________________时说明质粒b成功插入了Neo基因，理由是___________________________________________________________。

组别	T₁	T₂	CTR
培养基	不含G418	含G418	含G418
细胞生长情况	未死亡	？	全部死亡

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知识点：动物细胞培养技术基因工程的操作程序综合答案解析【答案】很抱歉，登录后才可免费查看答案和解析！

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我国是世界最大的棉花消费国，棉花生产量稳居世界第二。科研小组利用基因工程技术将某抗虫基因转入棉花成功培育出抗虫棉，该技术所用的质粒与含抗虫基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示（不同限制性内切核酸酶的识别序列和酶切位点如下表所示）。请分析并回答下列问题：

限制性内切核酸酶名称	识别的碱基序列和酶切位点
BamHⅠ	G↓GATCC
BclⅠ	T↓GATCA
Sau3AⅠ	↓GATC
HindⅢ	A↓AGCTT

（1）利用PCR技术扩增抗虫基因时，一个基因连续扩增4次，共需要____个引物，设计引物序列的主要依据是______________。
（2）图2质粒的作用是___________，质粒中没有标注出来的基本结构是________。
（3）用图中的目的基因和质粒构建抗虫棉基因表达载体时，科研人员分别选用限制酶BamHⅠ切割质粒、选用限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段。
①研究发现，含目的基因的DNA片段完全酶切后，反应管中有_______种DNA片段，得到含目的基因的DNA片段末端碱基序列是________________。
②科研人员将上述限制酶切割的质粒与目的基因混合，加入DNA连接酶后，成功导入受体细胞，然后分别用含X、Y抗生素的两种培养基对受体细胞进行筛选，结果发现，部分受体细胞在两种培养基上均不能存活，试分析其原因是___________________。
③某同学认为，在构建抗虫棉基因表达载体的过程中，可采用限制酶HindⅢ切割质粒和含目的基因的DNA片段。请对该同学的观点做简要评价______________。
（4）生产上常将获得的转基因抗虫棉与普通棉花混合播种，其目的是___________。

研究人员从分解纤维素的细菌（A菌）中提取出一种纤维素酶基因（CBHⅡ）并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒（图1）连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌（B菌）。请回答下列问题：

(1)构建成重组质粒时，应选择限制酶____对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段（X和Y），X两端的黏性末端分别为—CTAG和—CAATG，则Y两端的黏性末端分别为—CTAG和____。
(2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，因此在扩增CBHⅡ基因时，需要在两种引物的____（填“5′”或“3′”）端分别添加相应限制酶的识别序列。图2中B链为CBHⅡ基因的模板链，结合第（1）问中的酶切结果分析，引物2需要添加的序列为____。
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素____（填“M”或“N”）的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示（片段过小时检测不到条带）。据图分析，菌落____中成功导入了重组质粒。
(4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基巾纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种____，说明____。

培育转基因生物时，首先要在体外对含有所需基因的DNA进行加工，其中包括将不同的DNA片段连接起来形成重组DNA。回答下列问题：
(1)图1中，HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ是3种不同的限制酶，且产生的黏性末端不同，GFP基因是绿色荧光蛋白基因。PCR扩增目的基因时，在两种引物的______（填“5′”或“3′”）端分别加上EcoRⅠ、BamHⅠ的识别与切割序列，该过程使用两种而不是一种限制酶的目的是______。

(2)图1获得的重组表达载体的标记基因是______。将筛选出的重组表达载体转染成纤维细胞，再利用该成纤维细胞进一步培育转基因动物。如何利用该成纤维细胞培育转基因动物，请简述实验思路：________。
(3)重叠延伸PCR技术采用具有互补末端的引物使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸将不同来源的片段重叠拼接在一起形成重组DNA，该技术成功的关键是重叠互补引物的设计。图2表示通过重叠延伸PCR技术拼接基因A和B的过程，步骤②得到的两种重叠产物中，目标产物是______，判断理由是______。其中步骤④加入的引物是______。与图1获得的重组表达载体相比，图中重叠延伸PCR技术形成重组DNA，不需要______酶。

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