研究人员将黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。图2是高产糖化酶基因及PCR扩增-组卷网

非选择题-解答题较难0.4 引用2 组卷122

研究人员将黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。图2是高产糖化酶基因及PCR扩增后的示意图（仅示部分碱基），甲、乙、丙和丁为引物。请回答下列问题。

(1)______是培育直接利用淀粉的工程菌的核心步骤。
(2)获取目的基因需要利用PCR技术扩增目的基因，应选用的引物组合为________，并在其_______（填“5'”或“3'”）端添加限制酶切割位点。A为扩增后添加限制酶切割位点，则图中A处的碱基序列应为________。
(3)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，并且对氨苄青霉素敏感，因此可最好利用________的培养基（不含淀粉）筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115（重组细胞），再将筛选出的细胞转接至含_____的培养液（含淀粉）中进行发酵产酶性能测定。

23-24高三下·山东聊城·阶段练习

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知识点：PCR扩增的原理与过程基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定答案解析【答案】很抱歉，登录后才可免费查看答案和解析！

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糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母CS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图所示。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Amp^r转录的模板链属于b链的片段。请回答下列问题。

(1)经诱变获得高产菌株后，获取高产糖化酶基因并对其进行PCR扩增，为了方便切割且能够准确和运载体结合，需要在两种引物的__________________（5'或3'）端连接限制酶__________________识别的序列。扩增过程中需要__________________催化。
(2)将高产糖化酶基因表达载体导入毕赤酵母，并且在其细胞内维持稳定和表达的过程称为____________。高产糖化酶基因表达时，__________________酶识别启动子并与启动子结合开启转录，其转录时的模板链属于__________________链的片段。
(3)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因此可利用__________________的基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115，再将筛选出的细胞转接至含__________________的培养液（含淀粉）中进行发酵产酶性能测定。

糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母CS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Amp^r转录的模板链属于b链的片段。三种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题。

限制酶	BamHI	PstI	XbaI
识别序列和切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到___________含量高的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径___________的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)质粒复制的模板链是___________（选填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）链。高产糖化酶基因插入质粒后，其转录的模板链属于___________链的片段。
(3)构建高产糖化酶基因表达载体时，使用限制酶切割pPIC9K，37℃，15min后需将温度升高至65℃并保温20min，目的是使___________，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，则PCR扩增时引物的碱基序列为___________。

①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′             ②5′-TCTAGAAGACAACTTA-3′
③5′-CTGCAGCTTGGATGAT-3′             ④5′-GGATCCCTTGGATGAT-3′
⑤5′-GGATCCGAACCTACTA-3′             ⑥5′-CTCGAGTCTGTTGAAT-3′
(4)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因此可利用________的基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115，再将筛选出的细胞转接至含甲醇的培养液中进行发酵产酶性能测定。

糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶。大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。请回答下列问题。

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到淀粉含量_____（填“高”或“低”）的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈直径_____（填“较大”或“较小”）的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)为获取和扩增高产糖化酶基因，研究人员提取出糖化酶高产菌株的基因组，并根据高产糖化酶基因的部分核苷酸序列设计_____进行PCR扩增。PCR每次循环都包括变性、_____和延伸三步，在循环前常要进行一次94°C、5min预变性，其目的是_____。
(3)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶EcoRI和NotI切割质粒pPIC9K，37°C，15min后需将温度升高至65°C并保温20min，目的是使_____，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能正确插入表达载体并成功表达，则图中A处的碱基序列应为_____。

(4)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，并且对氨苄青霉素和卡那霉素均不敏感，因此可利用_____的基础培养基筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115（重组细胞），再将重组细胞转接至以甲醇为唯一碳源的培养液中进行发酵产酶性能测定。上述过程中，甲醇除作为碳源、提供能量外，还具有_____的作用。
(5)为进一步揭示黑曲霉菌高产糖化酶基因突变的分子机制，研究人员将高产糖化酶基因上游表达调控序列与野生糖化酶基因同一区段的序列进行对比分析，具体差异如图3，据此推测，糖化酶基因突变可能是该序列发生了碱基（对）的_____所致。

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