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非选择题-实验题 适中0.65 引用1 组卷123
白细胞介素12(IL-12)是免疫应答中的异二聚体糖蛋白,由p35和p40两个亚基经两个二硫键共价结合而成,对人体抗癌免疫系统有非常重要的调节作用。由于p35和p40基因分别定位于不同的染色体,两基因同时表达且p40和p35以1:1的比例形成的异二聚体才具有生物活性。若两基因表达效率不同,则形成的IL-12二聚体的活性大大降低。为避免上述不利情况的发生,科学家尝试用下图所示方案构建了含有p40和p35cDNA序列的IL-12融合基因。其中P1、P2、P3、P4为PCR引物。P2和P3除含有与p40基因和p35基因互补的碱基序列外,在5'端含有36个组成Linker的碱基序列,它们之间有27个碱基互补。

(1)p40的cDNA序列____________(填“能”或“不能”)包含终止密码子的编码序列,理由是____________
(2)构建IL-12融合基因时,首先利用引物P1、P2扩增p40基因,利用引物P3、P4扩增p35基因,然后经过一个循环的变性、退火和延伸,即通过重叠延伸法得到少量的IL-12融合基因。之后以____________为引物,大量扩增出IL-12融合基因。据图分析IL-12融合基因中的Linker序列共有____________对碱基。
(3)可利用递减PCR扩增目的基因。递减PCR是在开始时先设定一个比较高的复性温度(如62℃),每个循环复性温度下降1℃,到一个较低温度(如52℃)以后每个循环的复性温度保持不变直到结束。递减PCR较常规PCR技术的优势是______________
(4)已知限制酶Xhol的识别序列:5'-C'TCGAG-3'Nhel的识别序列:5'-G'CTAGC3',根据下表中相关引物的碱基序列,判断引物P1和P4中分别引入了限制酶______________的序列,P3的5'端的前10个碱基序列是________________
引物碱基序列
P15'CTAGCTAGCGATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCT3'(35个碱基)
P25'ACCACCAGAGCCCCCGCCCCCGCTTCCTCCTCCTCCACTGCAGGGCACAGATGCCCATT3'(59个碱基)
P45'CGCCTCGAGTTATTAGGAAGCATTCAGATAG3′(31个碱基)

(5)科学家将构建成功的IL-12融合基因(共有1630个碱基对,其中没有内含子)转染树突状细胞(DC),请利用PCR技术检测IL-12融合基因是否表达出mRNA。实验设计思路是:
提取______________,进行RT-PCR扩增,检测扩增产物中_________________________
23-24高二下·江苏泰州·期中
知识点:PCR扩增的原理与过程DNA重组技术的基本工具目的基因的检测与鉴定 答案解析 【答案】很抱歉,登录后才可免费查看答案和解析!
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噬菌体展示技术是将外源蛋白基因插入到噬菌体外壳蛋白基因的适当位置,使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。为准确检测诊断膀胱癌,研究者利用噬菌体展示技术以膀胱癌细胞特异性表达的U蛋白作为靶蛋白,从人体细胞中获得多个基因并分别插入不同的噬菌体展示表达载体-噬菌粒(下图2)构建出多个重组载体,然后在噬菌体表面表达出可与U蛋白特异性结合的蛋白S。

(1)已知真核生物编码起始密码子的序列偏好ATG,而原核生物偏好GTG。为保证目的基因按正确方向插入噬菌粒且能更好地表达,结合图1和图2分析,引物1的5′端序列的合理设计是________________,设计引物2时________(填“能”或“不能”)包含外源蛋白基因终止密码子的编码序列,理由是________
(2)设计引物后可利用递减PCR扩增目的基因。递减PCR是在开始时先设定一个比较高的复性温度(如62℃),每个循环复性温度下降1℃,到一个较低温度(如52℃)以后每个循环的复性温度保持不变直到结束。递减PCR较常规PCR技术的优势是__
(3)将构建的多个重组载体分别导入不同大肠杆菌后可稳定存在,因为噬菌粒具有__________。然后利用辅助噬菌体感染大肠杆菌帮助丝状噬菌体完成增殖,并将____________展示在丝状噬菌体表面。
(4)将U蛋白固定在特定介质上,加入步骤(3)得到的____________混合孵育,经第一次非特异性洗脱液洗脱后,第二次用含U蛋白单抗的洗脱液冲洗的目的是____________,然后收集第二次洗脱液,提取相关DNA进行测序,获得与膀胱癌细胞特异性结合的蛋白S对应的基因。为进一步检测噬菌体展示技术得到的蛋白S与U蛋白的结合力,研究人员做了相关实验,结果如图3所示,由此可得出噬菌体展示技术得到的蛋白S比人体细胞合成的蛋白S与蛋白U结合的结合力小,原因最可能是_____________
胰岛素基因表达的最初产物是前胰岛素原,经加工后形成有生物活性的胰岛素。科学家提出利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法:AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段,利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素;BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因,表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。两种方法使用的质粒及目的基因的部分结构如下图所示,请据图分析并回答问题:

(1)在人体胰岛B细胞内,前胰岛素原形成具有生物活性的胰岛素过程中参与的细胞器有_________
(2)如构建乳腺生物反应器批量生产人胰岛素,需通过_________获得cDNA,再PCR后获得人胰岛素基因。在PCR过程中温度先上升到90℃以上,后降低到50℃其目的分别是_________ 。一条单链cDNA在PCR仪中进行n次循环,需要消耗_________个引物。
(3)AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列,可能的原因是__________________法(填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”)获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(4)为使目的基因与载体正确连接,在设计PCR引物时可添加限制酶_________的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后,需要通过PCR技术进行扩增,已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-,则其中一种引物设计的序列是5'_________3’。
(5)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后,采用_________法将大肠杆菌接种到添加了_________的培养基上筛选出_________色的菌落即为工程菌种。
干扰素具有干扰病毒复制作用,对治疗乳腺癌、淋巴癌、多发骨髓瘤和某些白血病等也有一定的疗效。
I.下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程,①~④表示相关的操作,EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶,它们的识别序列及切割位点如下表所示。请回答:

限制酶

识别序列和切割位点

EcoR l

G↓AATTC

BamH l

G↓GATCC


(1)步骤①中常利用PCR技术获取和扩增干扰素基因,除含有干扰素基因的DNA片段之外,该过程需要提供_________以及引物。设计引物序列时的主要依据是_________,科研人员还需在两种引物的一端分别加上相应的碱基序列,以便于后续基因的剪切和连接,这两种碱基序列分别是_________
(2)过程②所构建的基因表达载体中标记基因的作用是_________
(3)过程③中需先用_________处理根瘤农杆菌,可使根瘤农杆菌处于_________的状态,以便将基因表达载体导入细胞。
(4)④过程检测人参愈伤组织细胞是否产生干扰素,所用的方法是_________
II.干扰素在体外保存相当困难。科学家采用重叠延伸PCR技术,将干扰素基因中相应位点的C//G碱基对特定突变为G//C碱基对,从而使干扰素中的第17位氨基酸由半胱氨酸变成丝氨酸。该技术采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来,获得定点突变的干扰素基因,然后导入受体细胞生产表达新的干扰素,这种改造的干扰素可在-70℃条件下保存半年。原理如图。

(5)利用重叠延伸PCR技术诱变干扰素基因时,将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中,制备出“PCR体系1”和“PCR体系2”,分别进行PCR扩增。“PCR体系1”中加入的引物是_________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是_________。得到图中由c、d链构成的完整DNA分子至少需要“PCR体系2”进行_________次循环。
(6)将PCR体系1、2的产物(图中ab和cd)混合后,继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后,当温度下降到55℃,能够互补配对的DNA链相互结合,理论上有_________种结合的可能,其中能进行进一步延伸的有_________种。

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