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非选择题-实验题 较难0.4 引用8 组卷197
A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用,科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合,构建A蛋白检测探针,通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。

注:①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因;Tetr为四环素抗性基因;Ampr为氨苄青霉素抗性基因②F1、F2、R1、R2为引物③BamH I、Sma I、Bcl I为限制酶
(1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有__________。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5'端序列与_________互补。
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒,选用的限制酶为__________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________
①5'-…CTTGGATGAT-3'②5'-…TAAGTTGTCT-3'③5'-…ATTCAACAGA-3'       ④5'-…TCTGTTGAAT-3'
(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中,需要筛选两次,这两次筛选分别是_________
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色,将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间,然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定,结果如下表所示:
部位
完全培养液蓝色浅蓝浅蓝
缺磷培养液深蓝蓝色浅蓝
分析表明,该激素最主要的合成部位是__________,通过实验结果分析该激素的生理作用是_________
2024·山东潍坊·二模
知识点:PCR扩增的原理与过程DNA重组技术的基本工具基因表达载体的构建验证性实验与探究性实验 答案解析 【答案】很抱歉,登录后才可免费查看答案和解析!
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磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化,研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合,构建有效监测细胞PA变化的荧光探针,并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如下图,请回答:

   

注:bar为草胺膦抗性基因;Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时,T5核酸外切酶沿___(填“5'→3'”或“3'→5'”)的方向水解DNA,形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37°C,而过程①选择的温度为50°C,目的是___
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”,因此过程③所需的酶有___
(3)PCR技术中通常要设计引物,引物的作用是___,有时需要在引物的一端增加限制酶酶切位点,目的通常是___。PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的基因片段时,所用的引物F1和R2可对应下表中的___(填序号)。
5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3'
5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3'
5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3'
5'GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3'

(4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,将获得的种子进行表面消毒,均匀铺在含___的MS培养基上进行筛选和鉴定,将筛选得到的种子种植可得到转基因拟南芥,通过观测转基因拟南芥根尖细胞中___,了解PA的分布和含量。
In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20bp),然后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5’→3’末端16个碱基,并使其降解)处理即可实现无缝连接。如图是将氨苄青霉素抗性基因(目的基因)与线性化质粒无缝连接的操作步骤。回答下列问题:
       
(1)过程①反应体系中,除图中所示物质外还需添加______,质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为______个。
(2)In-Fusion酶的作用原理是:该酶识别线性化DNA片段末端,按照5’→3’方向,依次断裂______键,最终使线性化DNA片段两端出现黏性末端。为保证过程②扩增出能与线性化质粒连接的目的基因,设计引物A或引物B的依据是______的碱基序列,以保证扩增出的目的基因和线性质粒两侧含有同源序列。
(3)过程④中,用______处理大肠杆菌,以便重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和______酶,实现完全环化。
(4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含______的液体培养基中培养一段时间,然后分别用显微镜计数法和______法进行计数,计数结果分别是M、N,则致死率可用______×100%表示。此结果较真实值偏大,原因是后一种计数时______
(5)与传统构建重组质粒的方法相比,In-Fusion技术的优势之一是______
为使水稻获得抗除草剂性状,科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株,获得抗草甘膦转基因水稻。
   
注:GUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色
(1)将草甘膦抗性基因作为________,与Ti质粒用相同的______和DNA连接酶处理构建基因表达载体。
(2)用________处理农杆菌后获得感受态细胞,将其与基因表达载体混合完成转化后,在添加_____的培养基中,经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
(3)取某品种水稻的幼胚,先进行_______处理,然后接种到培养基中,水稻幼胚细胞发生___________形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。
(4)PCR扩增时需要根据草甘膦抗性基因序列设计_______种引物,引物是_________________
(5)利用PCR技术,可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基因的部分序列如下:
5’---ATGGCT………AGGAAC---3’
3’---TACCGA………TCCTTG---5’
根据上述序列应选择引物         (填字母)进行PCR。
A.引物:5’-TACCGA-3’B.引物:5’-GTTCCT-3’
C.引物:5’-AUGGCU-3’D.引物:5’-ATGGCT-3’
(6)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外,还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2,以确定目的基因是否____。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的________过程,获得转基因水稻。

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