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非选择题-实验题 较难0.4 引用1 组卷262
具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌,侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加,导致结直肠肿瘤的形成。细菌培养与鉴定等传统检测技术费时费力,不能满足快速检测的需求。科研人员采用基于滚环扩增技术(RCA)的荧光标记滚环扩增检测方法,实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度和高特异性的检测。下图1为RCA的原理示意图,图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图,其中,nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因,锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子,检测探针中的荧光基团(FAM)距离淬灭基团(BHQ-1)在一定的范围内时,荧光会被淬灭。请回答下列问题。

   

(1)RCA反应体系中需添加多种物质,除图1所示物质外,还应添加的物质是___RCA产生长重复单链DNA过程中,Phi29DNA聚合酶既需催化___键的形成,也需催化___键的断裂。
(2)过程②为锁式探针进行连接以实现环化,该过程中需要的酶是___过程③中,需添加核酸外切酶进行“消化”,据图分析“消化”的目的是___,推测核酸外切酶的作用是___,消化完成后,需将反应体系置于95℃条件下持续20min后再进行RCA扩增,目的是___
(3)过程④通过RCA扩增得到长重复单链DNA,与常规PCR相比,RCA缺乏___环节,说明RCA扩增过程中所使用的Phi29DNA聚合酶不具有___特性。
(4)若检测样品存在具核酸杆菌,经图2中②-④过程得到的长重复单链DNA与___特异性结合,导致FAM与BHQ-1距离增大,发出荧光。因为___,提高了该检测方法的灵敏度;肠道中含有多种微生物,为保证检测的特异性,在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG基因的特异性序列,同时还需注意无关序列中___
23-24高三下·江苏镇江·开学考试
知识点:PCR扩增的原理与过程 答案解析 【答案】很抱歉,登录后才可免费查看答案和解析!
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滚环扩增技术(RCA)是借鉴自然界中病原生物体环状DNA分子滚环式复制方式发展起来的一种核酸扩增方法,在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒检测领域有着广泛应用。图1为RCA原理示意图。具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌,侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加,导致结直肠肿瘤的形成。科研人员采用基于RCA的荧光标记滚环扩增检测方法,实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度、高特异性的检测。图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图,过程②是使锁式探针环化的过程。其中nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因,锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子,由两端的检测臂和无关序列组成。只有当环境中存在靶核酸序列时,锁式探针才能完成成环连接反应。检测探针中的荧光基团(FAM)距离淬灭基团(BHQ-1)比较近时,荧光会被淬灭。

   

(1)由图1推测,Phi29DNA聚合酶的作用是___________。与常规PCR相比,RCA缺乏___________环节,因此可推测RCA扩增过程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有___________的特性。
(2)过程②锁式探针完成成环连接反应需要___________的催化。肠道中含有多种微生物,为保证检测的特异性,在设计锁式探针时需保证____________,同时还需注意无关序列中不含____________
(3)若检测样品存在具核梭杆菌,检测探针中荧光基团发出荧光的原理是___________。该检测方法具有高灵敏度的原因是___________
目前医院进行流感病毒核酸检测的方法为实时荧光定量PCR(qPCR)检测法,技术流程如下图1。近年来滚环扩增技术(RCA恒温核酸扩张技术)也开始应用于病原体的检测,其原理如图2。图3为荧光标记滚环扩增检测过程示意图,其中,nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因,锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子,检测探针中的荧光基团(FAM)距离淬灭基团(BHQ-1)在一定的范围内时,荧光会被淬灭。请回答下列问题。

   



(1)图1中qPCR过程中,需要先以RNA为模板,经过___过程合成cDNA,来设计一对引物。图2中RCA反应体系与qPCR反应体系类似,也需添加引物,引物的作用是___。除图2所示物质外,还应添加的缓冲液和___,其作用是___
(2)在qPCR扩增过程中,若探针完整时,不产生荧光,当探针被酶X水解时,R与Q分离,即可检测出R发出荧光。由此可推测,探针的水解发生在PCR循环的___阶段。
(3)在qPCR中ct值含义是“每个反应管内荧光强度达到设定阈值时所经历的循环数”,根据某试剂盒说明书显示ct≤40则为阳性,若每分子探针水解释放的荧光强度为a,加入模板RNA数为b,则设定的荧光强度阈值应为___
(4)图2中RCA产生长重复单链DNA过程中,Phi29DNA聚合酶既需要催化___键的形成,也需要催化___键的断裂,才能实现连续合成。
(5)图3过程④通过RCA扩增得到长重复单链DNA,与qPCR循环相比,RCA过程缺乏___环节。推测Phi29DNA聚合酶与Taq酶相比不具有___特性。
(6)若检测样品存在具核梭杆菌,经图3中②~④过程得到的长重复单链DNA与检测探针特异性结合,导致FAM与BHQ-1距离___,从而发出荧光。因为___,大大提高了该检测方法的灵敏度。
对新型冠状病毒进行核酸检测其实就是对新型冠状病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)法。为检测某人是否感染了新型冠状病毒,需要进行以下相关操作:①分析PCR扩增结果;②从组织样本中提取RNA;③RT(逆转录)成cDNA;④采集样本(咽拭子或鼻拭子);⑤利用PCR扩增DNA片段。回答下列问题:
(1)若要得到正确的核酸检测结果,正确的操作顺序应该是_____(用数字序号表示)。核酸检测样本多采集于咽、鼻,这些部位存在多种微生物,提取物中核酸种类可能有多种,但通过PCR技术可专一地对新型冠状病毒的核酸序列进行扩增,原因是_____
(2)操作⑤中,需设计2种引物,需要提供引物的原因是_____;反应体系中加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP的作用是_____;复性时温度的设定是该步操作成败的关键,而复性的作用是_____
(3)PCR扩增时,在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针,其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团,如图所示:

   
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;_____在催化子链延伸时,还具有外切酶活性,它可以沿着_____(填“5'→3'”或“3'→5'”)方向将探针酶切,使报告基团和淬灭基团分离,随着DNA扩增次数的增加,荧光的强度会逐渐增大,从而实现荧光信号的变化与_____的形成完全同步。
(4)除了荧光检测法,还可以通过_____法分析PCR扩增结果。

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