酵母菌是发酵工业的重要微生物，主要用于生产酒精。酒精不仅是化工和制药的重要原料，又可以作为清洁燃料，在环境保护上具有特别重要的意义。我国酒精生产主要使用淀粉为原-组卷网

非选择题-解答题适中0.65 引用2 组卷63

酵母菌是发酵工业的重要微生物，主要用于生产酒精。酒精不仅是化工和制药的重要原料，又可以作为清洁燃料，在环境保护上具有特别重要的意义。我国酒精生产主要使用淀粉为原料，但酒精酵母不具有淀粉水解酶的活性不能直接发酵淀粉，淀粉需先经过糖化等工序在淀粉酶的作用下被水解成葡萄糖后才能被利用。通过基因工程将黑曲霉的酸性α-淀粉酶基因转入酒精酵母中制成酒精酵母工程菌，以加快酒精发酵速度并提高淀粉原料的利用率和出酒率。
(1)酸性α-淀粉酶基因作为目的基因需要利用PCR技术快速扩增，PCR反应时需要提供目的基因模板、____。在常规PCR的每一轮扩增反应中，温度随时间的变化顺序是____。
A.94℃，60℃，72℃ B.60℃，94℃，72℃ C.94℃，72℃，60℃
(2)目的基因的载体—质粒pUC19，除具有复制原点、启动子、终止子，多个限制酶切割点外，还需具有____（如G418抗性）便于重组质粒的筛选。
(3)培养酒精酵母使用的是YPD培养基（每升含酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g），为检测重组质粒是否成功进入酵母细胞，在YPD培养基中加入200μg/ml的G418制成____（选填“选择”或“鉴别”）培养基。
(4)将待检测转基因酵母菌用无菌牙签点接在YNB平板上30℃培养3d后，用碘蒸汽熏染，观察____。
(5)取300μl成功的转基因酵母菌培养液上清液与300μl1%可溶性淀粉溶液混匀，60℃反应1h，100℃水浴煮沸10min灭活，用____同样操作作为对照。反应液中生成的葡萄糖用葡萄糖氧化酶试剂测定酶活性。
(6)将筛选出的酶活力高的三个转基因酵母菌株A、B、C在YPD平板上连续转移培养10次后，分别将原初菌株与转移5次和10次的菌株接种于YPD液体培养基，37℃振荡培养72h，测定上清液中的酸性α-淀粉酶活性，结果如下表。

品种/转移次数	酸性α-淀粉酶活性（U/ml）
菌种A	1.157
菌种A/5次	0.908
菌种A/10次	1.099
菌种B	0.919
菌种B/5次	1.103
菌种B/10次	0.806
菌种C	1.478
菌种C/5次	0.695
菌种C/10次	0.453

上述数据表明，菌株____不适合作为大规模发酵的工程菌使用，原因是____。

23-24高三上·全国·阶段练习

收藏试题下载试题加入试题篮

知识点：培养基的类型及其应用PCR扩增的原理与过程基因表达载体的构建目的基因的检测与鉴定答案解析【答案】很抱歉，登录后才可免费查看答案和解析！

类题推荐

糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶。大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。请回答下列问题。

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到淀粉含量_____（填“高”或“低”）的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈直径_____（填“较大”或“较小”）的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)为获取和扩增高产糖化酶基因，研究人员提取出糖化酶高产菌株的基因组，并根据高产糖化酶基因的部分核苷酸序列设计_____进行PCR扩增。PCR每次循环都包括变性、_____和延伸三步，在循环前常要进行一次94°C、5min预变性，其目的是_____。
(3)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶EcoRI和NotI切割质粒pPIC9K，37°C，15min后需将温度升高至65°C并保温20min，目的是使_____，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能正确插入表达载体并成功表达，则图中A处的碱基序列应为_____。

(4)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，并且对氨苄青霉素和卡那霉素均不敏感，因此可利用_____的基础培养基筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115（重组细胞），再将重组细胞转接至以甲醇为唯一碳源的培养液中进行发酵产酶性能测定。上述过程中，甲醇除作为碳源、提供能量外，还具有_____的作用。
(5)为进一步揭示黑曲霉菌高产糖化酶基因突变的分子机制，研究人员将高产糖化酶基因上游表达调控序列与野生糖化酶基因同一区段的序列进行对比分析，具体差异如图3，据此推测，糖化酶基因突变可能是该序列发生了碱基（对）的_____所致。

普通酵母菌利用淀粉的效率较低。研究人员将某海洋细菌中α-淀粉酶分子（B）基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种。请回答下列问题：
(1)采用PCR技术扩增B基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________（3'端/5'端）。

(2)通常需提取大肠杆菌的质粒用来构建B基因的表达载体。提取的主要步骤是培养大肠杆菌→裂解菌体→质粒DNA的复性→离心提取→鉴定。在裂解菌体时需添加溶液Ⅱ（主要成分为EDTA）、溶液I（主要成分为SDS），添加顺序是先加________，5min后再加________。在所提取的质粒上还需添加________（海洋细菌/大肠杆菌/酵母菌）的启动子、终止子等。
(3)在将B基因导入酵母细胞前，需先将酵母菌置于含醋酸锂的培养液中培养一段时间，从而提高转化效率。由此推测，醋酸锂的培养液可用于制备______。
(4)用B抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应。这为分离、纯化B蛋白提供的启示是______。以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种了工程酵母菌的发酵罐需要率先排气，其原因是______。
(5)如果将B的丝氨酸变成亮氨酸，改变后的α-淀粉酶分子（B）不但保留B的功能，而且具更高的催化活性。以B基因序列为基础，获得B₁基因的途径有修饰_______基因或合成________基因。

研究显示，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞会表达hCGβ蛋白，这与肿瘤的发生及转移可能有一定关系，通过各种生物反应器研发抗hCGβ蛋白已成为近年来肿瘤治疗领域热点问题。某制备抗hCGβ疫苗的流程如图1所示，其中启动子有物种特异性。

注：序列甲（320bp）指导合成的信号肽，能指引翻译后的多肽进入内质网腔；AXO1为甲醇诱导型的真核启动子，有甲醇存在的环境下才会启动表达。
回答下列问题：
(1)构建重组载体。图1中获取抗β基因的方法属于______，将抗β基因与甲序列一起构建形成融合基因，并与线性质粒连接。
(2)大肠杆菌转化。过程Ⅱ将环化质粒导入受体细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的平板，在恒温培养箱中______培养，以利于获得单菌落，筛选分离出含抗β基因的大肠杆菌。
(3)鉴定融合基因。为鉴定抗β基因与甲序列是否融合成功，提取大肠杆菌的______作为模板，设计相应引物对融合基因进行PCR并电泳。在PCR过程中，每一个循环均包括变性、______三个阶段。为使扩增产物能被限制酶用于后续实验，应在引物5′端添加______，电泳时将样品与______混合后加入加样孔。凝胶中加样孔的一端朝向电泳槽的______（正极/负极）。电泳后得到图2所示结果，根据______，可推测PCR产物的长度，因此可判断______号泳道的样品符合要求。

(4)导入酵母菌。过程Ⅳ—Ⅴ中，将处理后的酵母菌接种于培养基中，该培养基不需要添加的成分有______（A．组氨酸 B．甲醇 C．无机盐 D．琼脂），此培养基上形成的母菌菌落即为目的菌株，此步骤不能通过培养基中添加氨苄青霉素作为筛选条件获得目标菌株的原因是______（答出两点）。
(5)基因表达检测。将酵母菌接种后于______上振荡培养，将培养物离心后分成细胞和培养液两部分，将细胞用缓冲液重新悬浮，并______处理后，再次离心取上清液。用hCGβ蛋白对上清液和之前获得的培养液通过______技术进行检测，若两组均呈阳性，则说明基因在酵母菌中______。
(6)发酵罐生产。为了解发酵罐中酵母菌数量，取5g皮渣加入45mL无菌水中，按照此法，梯度稀释至104倍。取0.1mL稀释液涂布计数，三个平板中菌落数分别为56、62和56，则此时每克皮渣酵母菌数量是______个。
(7)蛋白活性检测。已知DNS在90℃以上可与还原糖发生显色反应，将β蛋白与淀粉酶制成β-酶复合体，β-酶复合体蛋白与抗β蛋白结合后会遮盖复合体空间构象，使酶无法正常执行功能。向离心管加抗β蛋白、β-酶复合体反应10min，再加入淀粉反应10min，立刻沸水浴处理2min，此时沸水浴的目的是______。随后加入DNS并沸水浴处理10min，通过测定反应液的颜色变化，推测抗β蛋白的活性。颜色反应越深，可以反映抗β蛋白的活性越______。β-酶复合体需要在低温下保存，原因是______。

组卷网是一个信息分享及获取的平台，不能确保所有知识产权权属清晰，如您发现相关试题侵犯您的合法权益，请联系组卷网