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非选择题-解答题 适中0.65 引用1 组卷243
对新型冠状病毒进行核酸检测其实就是对新型冠状病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)法。为检测某人是否感染了新型冠状病毒,需要进行以下相关操作:①分析PCR扩增结果;②从组织样本中提取RNA;③RT(逆转录)成cDNA;④采集样本(咽拭子或鼻拭子);⑤利用PCR扩增DNA片段。回答下列问题:
(1)若要得到正确的核酸检测结果,正确的操作顺序应该是_____(用数字序号表示)。核酸检测样本多采集于咽、鼻,这些部位存在多种微生物,提取物中核酸种类可能有多种,但通过PCR技术可专一地对新型冠状病毒的核酸序列进行扩增,原因是_____
(2)操作⑤中,需设计2种引物,需要提供引物的原因是_____;反应体系中加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP的作用是_____;复性时温度的设定是该步操作成败的关键,而复性的作用是_____
(3)PCR扩增时,在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针,其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团,如图所示:

   
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;_____在催化子链延伸时,还具有外切酶活性,它可以沿着_____(填“5'→3'”或“3'→5'”)方向将探针酶切,使报告基团和淬灭基团分离,随着DNA扩增次数的增加,荧光的强度会逐渐增大,从而实现荧光信号的变化与_____的形成完全同步。
(4)除了荧光检测法,还可以通过_____法分析PCR扩增结果。
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知识点:PCR扩增的原理与过程目的基因的检测与鉴定基因工程的操作程序综合新型冠状病毒及相关 答案解析 【答案】很抱歉,登录后才可免费查看答案和解析!
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近期爆发了新型冠状病毒(2019-nCoV)病例,该病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒。目前,对于该病毒的检测手段主要为利用荧光PCR试剂盒对其核酸进行检测。其原理是,通过提取病人样本中的RNA,进行反转录•聚合酶链式反应(RT-PCR,即先通过逆转录获得cDNA,然后以其为模板进行PCR),通过扩增反应将样本中微量的病毒信息加以放大,最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性,那么就可说样本中存在着病毒(已经感染),反之则说明没有感染。

(1)PCR扩增时在加入一对引物的同时还需加入一个特异性的荧光探针,其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团。如上图所示,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;Taq酶在催化子链延伸时,还具有外切酶活性,它可以沿着____________(填“5'→3'”或“3'→5'”)方向将探针酶切降解,使报告基团和淬灭基团分离。于是,随着DNA扩增次数的增加,荧光的强度会逐渐____________(填“增大”或“减小”),从而实现了荧光信号的变化与PCR产物的形成完全同步。
(2)目前2019-nCoV的全基因组序列测定已完成,这有利于我们在研发病毒核酸检测试剂盒时根据其基因组序列来设计___________
(3)此外,对新型冠状病毒感染的诊断还可以通过抗体检测,这需要利用动物细胞工程中的__________技术,其优点为______________
(4)为了预防、控制该病的发生、流行,科学人员正在紧急研发相应的疫苗,其中利用灭活的病毒制备的疫苗称为灭活疫苗,这里的“灭活”是指利用物理或化学手段使病毒失去_________,但是并不破坏病原体的_________。此外,还可以利用___________技术来表达抗原蛋白,以大规模生产疫苗。
PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。
I.如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图1(以EcoRI酶切为例)所示。
(1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成____________,从而形成环状DNA。
(2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键,温度过高会破坏______________________的碱基配对。

(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________(填数字“①、②、③、④”)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
PCR引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′   ②5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′
③5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′   ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′
(4)新冠病毒核酸定性检测原理:先以病毒RNA为模板利用__________酶合成cDNA,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段,然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。此方法为RT-PCR技术。
(5)如果探针是带有荧光标记的,即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中,加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合,探针完整时,报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处,探针被TaqDNA聚合酶降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光(如图2所示)。即每扩增1个DNA分子,就有1个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板,进行第4次循环时,需要消耗荧光探针____________个。
②检测时,荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性,推测可能的一个原因__________________________________
TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法,其基本原理是PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比,因此,通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。下面是TaqMan水解探针作用机理示意图。请回答下列问题:

(1)PCR的原理是_____。在反应体系中除模板外还需要添加的物质有_____,如果想要获得100个目的基因,在反应体系中加入2分子底物DNA的情况下,至少需要经过_____次PCR过程。
(2)从解旋过程进行分析,PCR扩增与体内DNA复制过程不相同的地方是_____(答出两点)。
(3)对新冠疑似患者进行核酸检测是目前最常用的检测手段,获得鼻拭子、咽拭子后,首先通过实时荧光定量PCR技术扩增目的基因片段,然后采用相应的DNA分子探针进行检测。此处的分子探针是_____,检测原理是_____
(4)研究人员采用PCR技术可以获得大量目的基因,此外,获得目的基因的方法还有_____(答出两种)。
(5)PCR过程中Taq酶从5'端切断TaqMan探针,释放荧光基团。根据荧光强度可对PCR产物进行定量分析,原理是_____

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