非选择题-解答题 适中0.65 引用1 组卷243
对新型冠状病毒进行核酸检测其实就是对新型冠状病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)法。为检测某人是否感染了新型冠状病毒,需要进行以下相关操作:①分析PCR扩增结果;②从组织样本中提取RNA;③RT(逆转录)成cDNA;④采集样本(咽拭子或鼻拭子);⑤利用PCR扩增DNA片段。回答下列问题:
(1)若要得到正确的核酸检测结果,正确的操作顺序应该是_____ (用数字序号表示)。核酸检测样本多采集于咽、鼻,这些部位存在多种微生物,提取物中核酸种类可能有多种,但通过PCR技术可专一地对新型冠状病毒的核酸序列进行扩增,原因是_____ 。
(2)操作⑤中,需设计2种引物,需要提供引物的原因是_____ ;反应体系中加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP的作用是_____ ;复性时温度的设定是该步操作成败的关键,而复性的作用是_____ 。
(3)PCR扩增时,在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针,其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团,如图所示:
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;_____ 在催化子链延伸时,还具有外切酶活性,它可以沿着_____ (填“5'→3'”或“3'→5'”)方向将探针酶切,使报告基团和淬灭基团分离,随着DNA扩增次数的增加,荧光的强度会逐渐增大,从而实现荧光信号的变化与_____ 的形成完全同步。
(4)除了荧光检测法,还可以通过_____ 法分析PCR扩增结果。
(1)若要得到正确的核酸检测结果,正确的操作顺序应该是
(2)操作⑤中,需设计2种引物,需要提供引物的原因是
(3)PCR扩增时,在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针,其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团,如图所示:
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;
(4)除了荧光检测法,还可以通过
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PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。
I.如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图1(以EcoRI酶切为例)所示。
(1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成____________ ,从而形成环状DNA。
(2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键,温度过高会破坏______________________ 的碱基配对。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________ (填数字“①、②、③、④”)。
(4)新冠病毒核酸定性检测原理:先以病毒RNA为模板利用__________ 酶合成cDNA,再通过PCR技术扩增相应的DNA片段,然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。此方法为RT-PCR技术。
(5)如果探针是带有荧光标记的,即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中,加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合,探针完整时,报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处,探针被TaqDNA聚合酶降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光(如图2所示)。即每扩增1个DNA分子,就有1个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板,进行第4次循环时,需要消耗荧光探针____________ 个。
②检测时,荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性,推测可能的一个原因__________________________________ 。
I.如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图1(以EcoRI酶切为例)所示。
(1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成
(2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键,温度过高会破坏
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) | |
已知序列 | |
PCR引物 | ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ③5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ |
(5)如果探针是带有荧光标记的,即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中,加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合,探针完整时,报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处,探针被TaqDNA聚合酶降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光(如图2所示)。即每扩增1个DNA分子,就有1个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板,进行第4次循环时,需要消耗荧光探针
②检测时,荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性,推测可能的一个原因
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