野生茄子具有耐盐基因StP5CS。研究人员扩增StP5CS基因并双酶切该基因和改造后的中间载体pCAMBIA1301 ，经DNA 连接酶连接酶切产物，最终得到下-组卷网

非选择题-解答题较难0.4 引用4 组卷497

野生茄子具有耐盐基因StP5CS。研究人员扩增StP5CS 基因并双酶切该基因和改造后的中间载体pCAMBIA1301 ，经DNA 连接酶连接酶切产物，最终得到下图1所示的植物表达载体pCAMBIA1301—StP5CS。将该植物表达载体导入植物细胞进而获得了耐盐植株。回答下列问题：

(1)提取茄子幼嫩叶片的总RNA，在 _____________ 的催化下合成cDNA，再通过PCR技术扩增StP5CS基因。PCR利用   ____________ 的原理。
(2)扩增StP5CS 基因的上游引物为 ZHPs: 5'-CACATTTCTGCTCCTACATT-3'，下游引物为ZHPa :5'-CTTCCTAAATACACAACTGGAT-3'，   两种引物中C+G 的比例保持一致主要是为了保证 _____________ 。StP5CS基因PCR扩增的每次循环分为3步，在循环前常要进行一次94℃、5min预变性，其目的是 ______________。
(3)构建耐盐基因StP5CS 表达载体时，用限制酶BamH I和SmaI切割质粒pCAMBIA1301，15 min 后需将温度从36℃升高至65℃左右并保温20 min，目的是___________ ，从而终止酶切反应。mRNA合成方向是

图2是StP5CS基因示意图，为使其能正确插入表达载体并成功表达，则图中P处的碱基序列应为 5'-______ -3'。
(4)若将该表达载体导入柑橘细胞中，常用_______________法，表达载体上的 Ori 可以保证其在柑橘细胞中能____________。

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知识点：PCR扩增的原理与过程基因工程的操作程序综合答案解析【答案】很抱歉，登录后才可免费查看答案和解析！

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糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶。大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。请回答下列问题。

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到淀粉含量_____（填“高”或“低”）的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈直径_____（填“较大”或“较小”）的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)为获取和扩增高产糖化酶基因，研究人员提取出糖化酶高产菌株的基因组，并根据高产糖化酶基因的部分核苷酸序列设计_____进行PCR扩增。PCR每次循环都包括变性、_____和延伸三步，在循环前常要进行一次94°C、5min预变性，其目的是_____。
(3)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶EcoRI和NotI切割质粒pPIC9K，37°C，15min后需将温度升高至65°C并保温20min，目的是使_____，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能正确插入表达载体并成功表达，则图中A处的碱基序列应为_____。

(4)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，并且对氨苄青霉素和卡那霉素均不敏感，因此可利用_____的基础培养基筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115（重组细胞），再将重组细胞转接至以甲醇为唯一碳源的培养液中进行发酵产酶性能测定。上述过程中，甲醇除作为碳源、提供能量外，还具有_____的作用。
(5)为进一步揭示黑曲霉菌高产糖化酶基因突变的分子机制，研究人员将高产糖化酶基因上游表达调控序列与野生糖化酶基因同一区段的序列进行对比分析，具体差异如图3，据此推测，糖化酶基因突变可能是该序列发生了碱基（对）的_____所致。

人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，以传统方法只能从血浆中制备，科学家利用基因工程和细胞工程技术制得了重组HSA（rHSA）。回答下列问题：
(1)获取HSA基因的途径之一是：提取总RNA，利用_____酶合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。已知HSA基因一条链两端的序列为5'AAGGGCGG-HSA基因-GGGAAACT3'，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是______（填字母）。若某一双链cDNA在PCR仪中进行了5次循环，则需要消耗____个引物。
A.引物I是5'-AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'-GGGAAACT-3'
B.引物I是5'-AAGGGCGG—3'，引物Ⅱ是5'-AGTTTCCC-3'
C.引物I是5'-CCGCCCTT-3'，引物Ⅱ是5'-GGGAAACT-3'
D.引物I是5'-CCGCCCTT-3'，引物Ⅱ是5'-AGTTTCCC-3'
(2)如图甲为获取的含有HSA基因的DNA片段，中间一段为HSA基因。Sau3AI、EcoRI、BamHI为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。

为保证目的基因和质粒正确连接，切割含有目的基因的DNA片段和质粒经常都会用到两种限制酶，在该实验中，切割含有目的基因DNA片段使用的限制酶为_______，原因是_____。
(3)若要在水稻胚乳细胞中提取rHSA，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是______；若要利用乳腺生物反应器来生产rHSA，则应将目的基因与_______等调控元件重组构建的基因表达载体，通过______方法导入_____ 受体细胞中。

糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母CS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因Amp^r转录的模板链属于b链的片段。三种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题。

限制酶	BamHI	PstI	XbaI
识别序列和切割位点（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到___________含量高的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径___________的菌株，再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)质粒复制的模板链是___________（选填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）链。高产糖化酶基因插入质粒后，其转录的模板链属于___________链的片段。
(3)构建高产糖化酶基因表达载体时，使用限制酶切割pPIC9K，37℃，15min后需将温度升高至65℃并保温20min，目的是使___________，从而终止酶切反应。图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，则PCR扩增时引物的碱基序列为___________。

①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′             ②5′-TCTAGAAGACAACTTA-3′
③5′-CTGCAGCTTGGATGAT-3′             ④5′-GGATCCCTTGGATGAT-3′
⑤5′-GGATCCGAACCTACTA-3′             ⑥5′-CTCGAGTCTGTTGAAT-3′
(4)毕赤酵母GS115是一种组氨酸营养缺陷型微生物，自身不能合成生长必需的组氨酸，因此可利用________的基础培养基（不含淀粉）初步筛选导入高产糖化酶基因表达载体的毕赤酵母GS115，再将筛选出的细胞转接至含甲醇的培养液中进行发酵产酶性能测定。

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