噬菌体DNA可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换，在此基础上发展起来的Gateway克隆技术是一种快速、高效构建基因表达载体的方法。该技术依靠载体上存在的特定-组卷网

单选题-单选适中0.65 引用3 组卷343

噬菌体DNA可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换，在此基础上发展起来的Gateway克隆技术是一种快速、高效构建基因表达载体的方法。该技术依靠载体上存在的特定重组位，点和克隆酶，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体，如图所示。下列有关叙述正确的是（）

A．利用PCR技术扩增目的基因时需在引物的3' 端添加attB1和attB2序列

B．目的基因的获取是基因工程的核心，图中未标出的结构有启动子、终止子等

C．为了从反应体系中筛选出质粒2，应在培养基上添加青霉素和卡那霉素

D．可用Ca²⁺处理大肠杆菌以促进其对环境中质粒4的吸收

2023·福建·三模

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知识点：PCR扩增的原理与过程基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定答案解析【答案】很抱歉，登录后才可免费查看答案和解析！

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Gateway克隆技术是一种快速，高效地构建基因表达载体的方法。这种方法基于，噬菌体可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换的特点设计，不用依赖限制酶，而靠载体上存在的特定重组位点和克隆酶，将目的基因克隆到其它的受体载体上。如图所示，Gateway克隆技术依赖于BP反应和LR反应，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体。请回答下列问题：

(1)构建的基因表达载体除含有图示的目的基因和标记基因外，还必须有___________。
(2)为构建基因表达载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增目的基因，用于扩增目的基因的引物需满足的条件是___________，为使PCR产物能参与后续交换，需要分别在2种引物上添加相应的attB1和attB2序列，该序列应添加在引物的___________（填3′端”或5′端”）。
(3)BP反应中，将带有atB1和attB2序列的目的基因与质粒1混合，加入BP克隆酶，atB和attP位点之间会发生互换。该反应体系中可能含有未交换的质粒1和交换后的质粒2，为从体系中筛选出质粒2，用混合体系中的质粒分别转化用Ca²⁺处理后的大肠杆菌，并涂布到含有青霉素的平板上。理论上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中含有的质粒即为质粒2，理由是___________。
(4)除本题所用接种方法外，也可以采用___________法进行接种，若培养结果如图所示，接种环节需灼烧接种环___________次。

(5)若将（3）中获得的含质粒2的大肠杆菌进行扩大培养，从物理性质考虑，一般采用___________培养基。

Gateway克隆技术是一种快速，高效地构建基因表达载体的方法，是基于λ噬菌体可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换的特点设计的。Gateway克隆技术依赖于BP反应和LR反应，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体，如图所示。请回答下列问题：

(1)为构建基因表达载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增目的基因，用于扩增目的基因的引物需满足的条件是______，为使PCR产物能参与后续交换，需要分别在2种引物上添加相应的attB1和attB2序列，该序列应添加在引物的______（填“3´端”或“5´端”）。
(2)BP反应中，将带有attB1和attB2序列的目的基因与质粒1混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换。该反应体系中可能含有未交换的质粒1和交换后的质粒2，为从体系中筛选出质粒2，使混合体系中的质粒分别转化用Ca²⁺处理的大肠杆菌，并涂布到含有青霉素的平板上。Ca²⁺处理的目的是______。理论上，在平板上长出菌落的大肠杆菌中含有的质粒即为质粒2，理由是______。
(3)LR反应中，将质粒2和质粒3混合，加入LR克隆酶，attL和attR位点之间会发生互换。为从反应体系中筛选出最终的基因表达载体，应将转化后的大肠杆菌涂布到含有______的平板上。获得的基因表达载体除含有图示的目的基因和卡那霉素抗性基因外，还必须有______等。
(4)在LR反应体系中，相应片段发生互换后，所得产物______（填“能”或“不能”）再次互换回到初始状态，原因是______。

三氯生是一种抑苗物质，可以替代抗生素用于基因工程中筛选含目的基因的受体细胞。2021年某科研团队通过先筛选出一种对三氯生抵抗性较强的重组质粒，再将可以受温度调控的基因插入该质粒上，构建了温度调控表达质粒。

(1)图1中，步骤1需要的工具酶是______________；步骤Ⅱ常用的方法是用____________处理使细菌成为感受态细胞；为达到步骤Ⅲ预期的筛选目的，所用物质X最可能为___________________。
(2)已知fabV基因（-A和-B代表从不同苗中获得）可以使大肠杆菌抵抗三氯生。在图中，fabV-A基因和 fabV-B基因是_____________（目的/标记）基因。
(3)利用从细菌中提取的DNA通过PCR技术获取fabV-A基因时，需要的特定酶是________。该酶只能从引物的________端延伸DNA链，而不能从头开始合成DNA，因此需要先根据_____设计两种特异性引物序列。
(4)为获得一种增强大肠杆菌对三氯生的抵抗作用效果较好的重组质粒，将含有不同质粒的大肠杆菌分别接种到相应培养基中。培养一段时间后，结果如图2，则适宜选作构建温度调控表达质粒的是_________。

(5)科学家对上述选出质粒进行改造，获得了图3所示质粒。其中P₁和P₂是启动子，可以启动转录；C基因在低温下会抑制P₁；R基因在高温下会抑制P₂；T₁和T₂是终止子，可以终止转录。如果将lacZ基因和GFP基因插入图质粒中，使得最后表现为高温下只表达GFP蛋白，而低温下只表达lacZ蛋白。则以下说法正确的有。

A．GFP基因插在R基因和终止子T₁之间

B．lacZ基因插在R基因和终止子T₁之间

C．GFP基因插在启动子P₂和终止子T₂之间

D．lacZ基因插在启动子P₂和终止子T₂之间

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