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非选择题-实验题 较难0.4 引用1 组卷408
肝再生磷酸酶-3 (PRL-3)在多种类型肿瘤的生长和转移进程中发挥着重要作用。为探究PRL-3在结直肠癌发生发展过程中的作用,科研人员做了相关研究。

(1)科研人员提取 Hela 细胞的总 RNA,经___________过程获得 cDNA。以 cDNA 为模板经 PCR 扩增出 PRL-3 基因。将质粒载体和 PRL-3 基因用 EcoR1、Xbal 两种酶进行切割后用___________酶处理,获得重组 PRL-3 质粒。此过程中进行双酶切的目的是___________
(2)将重组 PRL-3 质粒转入结直肠癌细胞系 SW620 细胞中,同时将___________作为对照,不做任何处理的 SW620 细胞作为空白对照,培养相同时间后检测三组细胞中的 PRL-3 蛋白的含量。若实验结果为___________,说明重组 PRL-3 质粒在 SW620 细胞成功表达。
(3)实验发现实验组的增殖能力明显强于空白对照组。进一步通过流式细胞术检测细胞周期情况,结果如图 1。 说明 PRL-3 通过___________促进细胞增殖中。
(4)miRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA, Dicer 是miRNA 产生过程中的关键酶。与正常组织相比,直肠癌组织内miRNA 的表达下降。为研究 PRL-3 与 miRNA 途径的相关性进行研究,结果如图 2。请阐述 PRL-3 在结直肠癌发生发展过程中的作用机理___________
22-23高三上·北京·期中
知识点:细胞增殖的方式及细胞周期DNA重组技术的基本工具目的基因的检测与鉴定筛选、获取合适的目的基因 答案解析 【答案】很抱歉,登录后才可免费查看答案和解析!
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研究发现HOXA7基因表达的蛋白质具有DNA结合及转录因子活性, 调控胚胎及成体细胞增殖、分化。科研人员对研究HOXA7基因在宫颈癌中的功能作用做了相关实验。请回答问题:
(1)癌细胞具有无限___________的特点,宫颈癌发生的根本原因是___________
(2)利用_____酶分别对HOXA7基因干扰序列—si-HOXA7(可以与HOXA7的mRNA发生碱基互补配对)和载体(plent-U6-GFP)进行切割,并用___________酶连接,构建表达载体plent-U6-GFP/si-HOXA7, 并以空载体plent-U6- GFP(NC)为对照。将重组质粒plent-U6-GFP/si-HOXA7和对照质粒plent-U6-GFP用脂质体转染宫颈癌Siha细胞,获得实验组细胞(Siha/si-HOXA7)和对照组细胞(Siha/NC)。分别采用RT-PCR法和抗原—抗体杂交检测获得细胞中的HOXA7 mRNA(图1A)和HOXA7蛋白质(图1B)水平,结果如图1。

注:GAPDH和β-actin在各组织和细胞中的表达相对恒定,作为参照物。
与对照组相比,实验组HOXA7基因表达的mRNA和蛋白质______________,说明_________(成功/未成功)建立可以用于后续实验的Siha/si-HOXA7细胞系。
(3)为进一步研究HOXA7对宫颈癌细胞体外增殖能力的影响, 取实验组细胞Siha/si-HOXA7和对照组细胞Siha/NC培养, 检测细胞的平板克隆形成能力,结果如图2(A);利用流式细胞术检测实验组和对照组的细胞周期,结果如图2(B)。

由图2(A)结果可知,与对照组相比,实验组细胞Siha/si-HOXA7_________,由此可以推测HOXA7基因能够________(促进或抑制)宫颈癌细胞体外增殖;结合流式细胞术检测结果,推测HOXA7对人宫颈癌细胞的作用机制是______________
研究发现,MZF1-AS1是一种长链非编码RNA,可以和核蛋白PARP1结合参与基因的调控,从而促进肿瘤细胞的增殖。科研人员通过PCR技术得到PARP1基因全长序列(图1),其编码的蛋白质含1014个氨基酸,三个功能区(图2),图中数字代表氨基酸对应的位置;构建含GST标签的重组载体以获得不同长度的融合蛋白。

(1)欲PCR扩增PARP1基因的编码区,需设计一对引物F1和R1,在图1中选出两引物与模板结合的位置_____(填图中序号),PCR反应体系中需要加_____酶,PCR产物一般通过_____法鉴定。
(2)为了得到GST-PARP1融合蛋白,需构建不同长度的带有GST标签序列的PARP1基因表达载体,GST序列尾端不能含有_____序列(不考虑移码突变);纯化得到6种融合蛋白,分别与体外转录得到的生物素标记的MZF1-AS1进行体外结合实验,形成RNA—蛋白质复合物,该复合物可通过一定技术分离出来,将分离纯化获得的结合在复合物上的RNA,经RT-PCR后鉴定结果如图3所示,据图可知_____

(3)研究发现,MZF1-AS1能促进转录因子E2F1与靶基因启动子结合,从而促进肿瘤细胞的增殖,MZF1-AS1和E2F1无直接相互作用,PARP1和E2F1有相互作用;将PARP1载体和E2F1载体共同转染5组细胞,细胞内E2F1含量相同。1、4组不做处理,2、5组MZF1-AS1基因过量表达,3组MZF1-AS1基因敲除处理。将5组细胞裂解,在4、5组细胞裂解液加入RNA酶,处理一段时间,然后分别在5组细胞裂解液中加入PARP1抗体得到沉淀,再分别利用E2F1抗体对上述沉淀中图4的蛋白质进行检测,结果如图所示,据图可知_____

(4)综上所述,MZF1-AS1对肿瘤细胞的作用机理是_____
研究发现,TRIM59基因在肝癌细胞中存在异常表达,可用于原发性肝癌的早期诊断。TRIM59蛋白含有R、B、C和TM四个功能区,如图1所示;科研人员采用一定的技术手段,获得了TRIM59基因的cDNA,分别构建TRIM59基因过表达及TRIM59基因敲除质粒,分别转染肝癌细胞株后,过表达及敲减细胞株的增殖情况如图2所示。

图1   TRIM59蛋白质功能区                 图2   TRIM59对肝癌细胞增殖能力的影响


(1)图2的实验结果表明____
(2)科研人员通过PCR扩增了图1中4种不同长度的蛋白质功能区组合片段所对应的TRIM59基因片段,并插入下图3所示的带FLAG标签序列(27bp)的载体中,与FLAG标签序列形成融合基因。FLAG是一种短肽,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响TRIM59蛋白功能区的功能。

图3


PCR扩增4种不同长度TRIM59基因片段需要的引物有____种;为了使目的基因正确插入,除∆R对应的TRIM59基因片段以外,在目的基因上游引物的5'端应插入____(“BamHI”或“EcoRI”)的识别序列,理由是____;可利用PCR技术验证融合基因是否构建成功,其实验思路是____
(3)体外实验发现TRIM59蛋白和PPM1B蛋白有结合现象。为了研究两蛋白在细胞内是否结合,科研人员分别将FLAG-TRIM59(FL)质粒、FLAG-TRIM59(R+B)质粒、FLAG-TRIM59(R)质粒、FLAG-TRIM59(∆R)质粒与带有GFP标签的GFP-PPM1B质粒共同转染受体细胞,以单独转染GFP-PPM1B质粒的受体细胞作为对照。分别利用FLAG抗体和GFP抗体对①至⑤实验细胞裂解液中的蛋白质进行检测,结果如图4中胶片一、二所示。再利用GFP抗体对上述FLAG抗体免疫沉淀中的蛋白质进行检测,结果如胶片三所示。

图4


图中实验结果说明____
(4)研究发现TRIM59蛋白的R功能区具有泛素化连接酶的活性,可介导泛素化途径降解PPM1B蛋白,PPM1B能够使某种蛋白去磷酸化进而抑制癌细胞的增殖和转移,据此可推测肝癌患者中TRIM59蛋白和PPM1B蛋白的量呈____相关。

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