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非选择题-解答题 较难0.4 引用5 组卷838
图甲为应用基因编辑去除CFTR基因(控制CFTR蛋白的合成),获得患囊性纤维病的编辑小鼠4的培育流程。请回答下列问题:

(1)对1号小鼠进行超数排卵处理,收集并选取处在__________.时期的卵母细胞用于核移植。
(2)采集2号小鼠的组织细胞,放置于37℃的CO2培养箱中培养,其中CO2的作用是__________
(3)尝试用基因疗法给刚出生的编辑小鼠4号治疗囊性纤维病。其中,将CFTR基因插入质粒中,构建了基因表达载体,其部分结构和酶切位点的示意图如乙,图中E1~E,四种限制酶产生的黏性末端各不相同。据图推断,在将CFTR基因插入质粒时,应使用_________限制酶,目的是__________
(4)为获得更多基因编辑小鼠,可在胚胎移植前对胚胎进行_________,所需要的主要仪器设备包括__________
(5)请设计一个实验,从分子水平检测CFTR基因是否被导入编辑小鼠4号并正常表达。
①实验思路:__________
②预期结果:__________
2021·河南开封·一模
知识点:动物细胞培养技术胚胎分割技术基因工程的操作程序综合基因编辑技术 答案解析 【答案】很抱歉,登录后才可免费查看答案和解析!
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新霉素磷酸转移酶基因(neo)是转基因动物中常用的标记基因,但neo存在于动物细胞中会影响动物体生长和发育。为实现在敲除目的基因后,将neo基因从基因组中敲除,科研人员构建了基于Cre-loxP重组系统的通用型基因打靶载体,并转染小鼠受精卵获得了Flox工具鼠。图1为loxP序列的结构示意图,图2为Cre-loxP重组系统的作用机理示意图,图3为通用型基因打靶载体的构建及Flox鼠建立过程示意图。请回答下列问题:

   

(1)loxP位点是一段长为34bp的序列,具有方向性,结合图1,推测其方向性由区段___________决定。Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段,并同时催化b区段箭头处___________键水解。
(2)据图2分析,若同一个DNA分子上具有2个同向的loxP位点,经Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子,从作用结果分析,Cre酶同时具有类似___________酶的作用;同一个DNA分子上具有2个反向的loxP位点,Cre酶仅能导致2个loxP位点间的序列反转连接,不能产生环状DNA分子,原因是______________________
(3)图3中,过程①可在限制酶和DNA连接酶等作用下,将同源臂1和同源臂2插入pAT质粒中的多克隆位点序列MCS中。作为通用型载体,pAT质粒的MCS中含有多个在基因组(待敲除基因所在DNA)中出现频率较低的酶切位点,其意义是____________
(4)两段存在同源序列(如同源臂)的DNA片段在重组酶的催化下,可发生同源重组,同源臂间的DNA序列可发生交换。为敲除特定基因,以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物,经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2,PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行的原因是_________________;为将同源臂定向插入pAT的MCS中,设计引物时需要在引物的___________端添加相应的限制酶切位点。
(5)过程②为重组pAT质粒转染小鼠受精卵的过程,该过程通常采用___________法。过程③需将转染后的受精卵置于适宜培养液中,培养24h后,能存活的胚胎为成功转染并整合到染色体DNA上的胚胎,后续通过___________等技术获得Flox小鼠。
(6)Flox小鼠中存在的neo基因,其两侧的2个LoxP位点的方向是___________的,可利用Cre酶将其敲除,获得不含neo基因的基因敲除鼠。为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除,可在Cre基因的cDNA一段添加___________实现。

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